Бактериальный белок, обладающий способностью к поглощению и испусканию в инфракрасной области спектра, был успешно «запущен в действие» в клетках млекопитающих. Этот белок может быть использован как нетоксичный краситель, что позволит улучшить изображение человеческого тела, получаемое на компьютерных томографах, а значит, поможет в диагностике и лечении многих заболеваний.
Область спектра, в которой излучает свечение полученный белок, — инфракрасная область, то есть с длиной волны больше 700 нм. Она расположена за пределами видимой области спектра, поэтому не воспринимается глазом, но может регистрироваться специальными приборами, аналогичными приборам ночного видения или датчикам, реагирующим на повышение температуры. Именно в интервале 650—900 нм в условиях живого организма оптическое отображение глубоких тканей получается с максимальной точностью. Поглощательная способность гемоглобина, воды и липидов при таких длинах волн минимальна. И при этом, в отличие от некоторых красителей, белок нетоксичен. Вдобавок к своим выдающимся функциональным свойствам этот белок обладает изюминкой: он испускает свечение без нарушения целостности и без токсичных влияний на живой организм млекопитающего!
Белок, который может использоваться для получения пространственного изображения «изнутри» живого организма на различных уровнях — от подклеточного уровня до отображения целых органов, был получен группой исследователей из Университета Калифорнии в Сан-Диего под руководством Сяокуня Шу (см. статью «Mammalian Expression of Infrared Fluorescent Proteins Engineered from a Bacterial Phytochrome» в журнале Science). Первым толчком к их работе послужило обнаружение того, что особый белок фитохром (см. вставку), выделенный из бактерии Deinococcus radiodurans и обладающий всего одной изменённой аминокислотой, способен к излучению в красной области спектра (622 нм). Эту бактерию можно назвать самой устойчивой бактерией в мире, так как она выживает во многих экстремальных ситуациях — например, при повреждающем ДНК действии токсических веществ, ультрафиолетовом и радиационном излучении, а также при обезвоживании или окислении. Вследствие таких необычных свойств этот микроорганизм был подвергнут многочисленным и разноплановым исследованиям.
Исследователи решили использовать эту любопытную бактерию, чтобы разработать новые красители, способные проникать вглубь человеческого тела и воссоздавать его картину изнутри, не являясь при этом токсичными веществами. Из целой молекулы фитохрома они с самого начала выбрали только один участок, отвечающий за связывание с молекулой партнёра. Ген, кодирующий выбранный участок (его размер — 321 аминокислота), был сконструирован с расчётом на его воспроизведение в известной «биологической фабрике» — кишечной палочке Escherichia coli. Когда спроектированный ген начинает функционировать в условиях «биологической фабрики» и обрабатывается светом с длиной волны приблизительно 700 нм, кодируемый им белок излучает в инфракрасной области (с максимумом при 722 нм). Тем не менее яркость свечения этого белка (названного IFP1.0, сокращение от infrared fluorescent protein) очень слабая, и к тому же он обладает двумерной структурой, затрудняющей проникновение белка внутрь клетки.
Чтобы улучшить полезные свойства полученного белка, дальнейшая работа была проведена с использованием направленного мутагенеза. Так называют воздействие на ДНК организма с целью получения как можно большего количества мутантных форм, обладающих свойствами, отличными от исходного микроорганизма. Обычно этот процесс запускается с помощью радиоактивного излучения или воздействия специальных химических веществ. В самом начале эксперимента последовательности ДНК для более чем 100 фитохромов были определены и обработаны специальными компьютерными программами, чтобы определить общие для всех этих молекул участки. Среди этих участков были выбраны 14 аминокислотных остатков, которые затем подверглись направленному мутагенезу. Полученные мутантные формы были протестированы на наличие способности испускать свечение в инфракрасной области.
Чтобы получить белок IFP1.4, обладающий яркостью в 4 раза большей, чем исходный, необходимо было повторить процесс мутагенеза несколько раз. В результате сконструированный белок обрёл способность к свечению при разной кислотности (в широком спектре pH — от 5 до 9) и одномерную структуру.
Природный фитохром, послуживший отправной точкой для всех последующих поколений белков, включает в себя — в качестве дополнительной группы — небольшую молекулу биливердина. Зелёный биливердин и его более широко известный компаньон красновато-жёлтый билирубин — красящие вещества, входящие в состав желчи. Биливердин образуется при распаде гемоглобина во всех аэробных организмах, включая животных. Например, обычный взрослый человек производит и усваивает около 300 и 500 мг биливердина каждый день.
Когда сконструированный белок IFP1.4 встраивается и начинает вырабатываться в печёночных клетках человеческого эмбриона, он обеспечивает равномерное свечение в инфракрасной области. При добавлении биливердина извне яркость свечения возрастает, что доказывает его способность проникать через клеточную мембрану и связываться с находящимся внутри клетки белком IFP1.4.
На следующем этапе исследований учёные поместили IFP в условия живого и целостного организма. Ген белка был встроен в наследственный материал вирусной частицы, а затем вирус впрыскивался при помощи шприца в хвостовую вену мышей. Через пять дней после инъекции было отмечено слабое свечение, производимое печенью в инфракрасной области. После внутривенного введения добавочного биливердина, действующего как усилитель свечения, уже через 10 минут было получено отчётливое трёхмерное изображение мышиной печени на компьютерном томографе. А ещё через час интенсивность свечения печени увеличилась в 5 раз, достигнув максимального уровня. Помимо способности наращивать яркость свечения сконструированного белка, биливердин проявил и другие полезные свойства. В использованных исследователями концентрациях он не только не вызывал токсичных явлений у мышей, но даже, по некоторым данным, проявил себя как антиокислитель и смог повысить сопротивляемость живого организма агрессивным формам кислорода.
В прошедшем 2008 году Нобелевская премия в области химии была вручена японскому учёному Осаме Симамуре за открытие зелёных светящихся белков (green fluorescent protein, GFP), которые он выделил из медуз ещё в 1962 году. Дальнейшие исследования позволили найти ген, кодирующий этот белок, и затем внедрить его в живые клетки различных организмов. В медицинских и биохимических исследованиях зелёным флуоресцентным белком или его производными помечают клетки (или вещества) и, благодаря свечению, отслеживают их расположение в пространстве и происходящие с ними изменения. Зелёный флуоресцентный белок позволил учёным пронаблюдать многие скрытые процессы и структуры: например, рост и характер связей нейронов, процессы, протекающие в стволовых клетках, а также распространение раковых клеток в организмах лабораторных животных. В сопроводительной речи Нобелевского комитета было отмечено, что эти белки на сегодняшний день являются одним из самых используемых в современной биологии инструментов, который позволяет наблюдать процессы, ранее недоступные для человеческого глаза.
Не исключено, что новый тип белков, способных светиться в инфракрасном свете, когда-нибудь тоже заслужит свою Нобелевскую премию. Важнее, впрочем, другое: возможно, открытие «красного маяка» произведёт в биологии и медицине революцию, подобную той, которая произошла в начале прошлого века после открытия, сделанного ещё в 1895 году Вильгельмом Рентгеном.
ОТПРАВИТЬ:
| Читать @chaskor |
